Zvířata, která dávají naději

Zvířata, která dávají naději

Oleg Makarov
"Populární mechanika" č. 4, 2016

Jedna z nejhorších onemocnění, která příroda přináší lidem, je genetická. Můžete se úspěšně vypořádat s příčinami onemocnění – bakteriemi a viry, ale pokud je problém v lidském genomu od narození, je extrémně obtížné pomoci pacientovi. Moderní věda trpělivě hledá příležitost "opravit" mutované geny.

Duchennová myodystrofie je jednou z častých, ale stále relativně běžných genetických onemocnění. Nemoc je diagnostikován ve věku od tří do pěti let, obvykle u chlapců, projevující se zpočátku pouze v obstrukovaných pohybech, ve věku deseti let trpících takovou myodystrofií už nemůže chodit, 20-22 let končí jeho život. Je způsobena mutací genu dystrofinu, který je na chromozomu X. Kóduje protein, který spojuje membránu svalové buňky s kontraktilními vlákny. Funkčně je to druh pružiny, který zajišťuje hladké snížení a celistvost buněčné membrány. Mutace v genu vedou k dystrofii kostní svalové tkáně, membrány a srdce. Léčba onemocnění je palivativní a umožňuje pouzezmírnit určité utrpení. S rozvojem genetického inženýrství se však na konci tunelu objevilo světlo.

O válce a míru

Genetická terapie je dodávka konstrukcí na bázi nukleových kyselin do buněk pro léčbu genetických onemocnění. Pomocí této terapie můžete opravit genetický problém na úrovni DNA a RNA, což mění proces exprese požadovaného proteinu. Například DNA může být dodána do buňky s opravenou sekvencí, se kterou je syntetizován funkční protein. Nebo naopak, jsou možné odstranění určitých genetických sekvencí, což také pomůže snížit škodlivé účinky mutace. Teoreticky je to jednoduché, ale v praxi je genová terapie založena na nejkomplexnějších technologiích pro práci s objekty mikrosvěta a je kombinací pokročilého know-how v oblasti molekulární biologie.

"Gene dystrofinu, jehož mutace produkuje Duchenne myodystrofii, je obrovský," říká vývojový ředitel biotechnologické společnosti Marlin Biotech, Ph.D., biologie Vadim Zhernovkov. "Obsahuje 2,5 milionu párů párů, které lze porovnat s v románu "Válka a mír".A představme si, že jsme vytahovali z eposu některé důležité stránky. Pokud jsou na těchto stránkách popsány významné události, pochopení knihy by bylo již obtížné. Ale gen je složitější. Hledání jiné kopie války a míru je snadné a pak se mohou číst chybějící stránky. Ale gen dystrofinu je v chromozomu X a u mužů je sám. Takže v pohlavních chromozomech u chlapců je při narození uložena pouze jedna kopie genu. Není tam nikde jinde.

Nakonec při syntéze proteinu z RNA je důležité zachovat čtecí rámec. Čtecí rámec určuje, která skupina tří nukleotidů se čte jako kodon, který odpovídá jedné aminokyselině v proteinu. Pokud je v genu fragment DNA, který není násobkem tří nukleotidů, dojde k posunu čtecího rámce – kódování se změní. Toto by bylo možné porovnat se situací, kdy po roztržených stránkách v celé zbývající knize budou všechna písmena nahrazena dalšími písmeny v abecedním pořadí. Zbavte se bezvýznamnosti. To je totéž, co se týče nesprávně syntetizovaného proteinu. "

Biomolekulární omítka

Jednou z účinných metod genové terapie pro obnovení normální syntézy proteinů je přeskakování exonů s použitím krátkých nukleotidových sekvencí.V technologii Marlin Biotech byla s touto metodou již vyvinuta technologie práce s genem dystrofinu. Jak je známo, v procesu transkripce (syntéza RNA) se nejdříve vytvoří tzv. Prematrixová RNA, zahrnující jak oblasti kódující protein (exony), tak nekódující (introny). Dále začne proces svařování, během něhož se oddělují introny a exony a vytvoří se "zralá" RNA sestávající pouze z exonů. V tomto okamžiku mohou být některé exony blokovány, "zakryty" pomocí speciálních molekul. Výsledkem je, že v zralé RNA nebudou existovat ty oblasti kódování, které bychom se raději zbavili, a tak se čtecí rámec obnoví, protein bude syntetizován.

"Tato technologie byla laděna. in vitro, – říká Vadim Zhernovkov, tj. Na buněčných kulturách rostoucích z buněk pacientů s Duchennovou myodystrofií. Ale jednotlivé buňky nejsou organismy. Při napadání buněčných procesů musíme efekty sledovat živě, ale není možné zapojit lidi do testování z různých důvodů, od etických až po organizační. Proto bylo nutné získat model Duchenne myodystrofie s určitými mutacemi založenými na laboratorním zvířeti. "

Jak okořit mikrosvět

Transgenní myši umožňují vytvářet živé modely těžkých lidských genetických onemocnění. Lidé by měli být vděční těmto drobným stvořením.

Transgenní zvířata jsou zvířata získaná v laboratoři, v jehož genomu se úmyslně, vědomě mění. V 70. letech minulého století bylo jasné, že tvorba transgenů je nejdůležitější metodou pro studium funkcí genů a proteinů. Jednou z nejčasnějších metod získání kompletně geneticky modifikovaného organismu byla injekce DNA do pronukleu ("prekurzor jádra") zygotů oplodněných vajec. To je logické, protože je nejjednodušší modifikovat genom zvířete na samém počátku svého vývoje.

Klenotníci žárlí. DNA injekce do pronucleus zygote je jednou z nejčasnějších a nejtradičnějších transgenních technologií. Injekce se provádí ručně pomocí ultrajemných jehel pod mikroskopem s 400násobným zvětšením

Vstřikování do jádra zygote je velmi netriviální procedura, protože mluvíme o mikroskopích. Vaječná buňka myši má průměr 100 μm a projádřka je 20 μm. Operace probíhá pod mikroskopem s 400násobným zvětšením, ale injekce je nejvíce ruční práce.Samozřejmě se pro "injekci" nepoužívá tradiční stříkačka, ale speciální skleněná jehla s dutým kanálem uvnitř, kde je shromažďován genový materiál. Jeden konec může být držen v ruce a druhý – velmi tenký a ostrý – je prakticky neviditelný pouhým okem. Samozřejmě, že taková křehká konstrukce borosilikátového skla nemůže být dlouhodobě skladována, proto je k dispozici laboratoří, která jsou na pracovišti vytažena na speciálním stroji těsně před prací. Používá se speciální systém kontrastního zobrazování buňky bez barvení – interference s pronukleus samotným je traumatické a je rizikovým faktorem pro přežití buněk. Barva by byla dalším takovým faktorem. Naštěstí jsou vajíčka poměrně houževnatá, ale počet zygotů, které způsobují vznik transgenních zvířat, tvoří jen několik procent z celkového počtu vajec, v nichž byla injekce DNA vyrobena.

Další fáze je chirurgická. Operace se provádí na transplantaci mikroinjektovaných zygotů do lučníku příjemci myši, která se stane náhradní matkou budoucího transgenu.Poté laboratorní zvíře projde těhotenským cyklem přirozeným způsobem a narodí se potomstvo. Obvykle ve vrhu je asi 20% transgenních myší, což také naznačuje nedokonalost metody, protože obsahuje velký prvek náhodnosti. Při injekci výzkumník nemůže kontrolovat, jak přesně budou vložené fragmenty DNA integrovat do genomu budoucího organismu. Existuje vysoká pravděpodobnost takových kombinací, které povedou ke smrti zvířete v embryonálním stádiu. Nicméně metoda funguje a je vhodná pro řadu vědeckých účelů.

DNA nůžky

Existuje však účinnější cesta založená na cílené úpravě genomu pomocí technologie CRISPR / Cas9. "Dnes je molekulární biologie poněkud podobná době dlouhých námořních expedic pod plachtou," říká Vadim Zhernovkov. , studovaný bakteriální druh je imunní vůči virovým infekcím. V důsledku dalšího výzkumu se ukázalo, že bakteriální DNA obsahuje specifická místa (CRISPR),z nichž jsou syntetizovány fragmenty RNA, které se mohou komplementárně vázat na nukleové kyseliny cizích prvků, například DNA nebo RNA viru. Protein Cas9, enzymová nukleáza, se váže na tuto RNA. RNA slouží jako vodítko Cas9, které označuje specifickou oblast DNA, ve které nukleáza dělá řez. Před asi třemi až pěti lety se objevily první vědecké články, v nichž byla technologie CRISPR / Cas9 vyvinutá pro editaci genomu. "

Protein-cutter. Diagram zobrazuje proces CRISPR / Cas9, který zahrnuje subgenomickou RNA (sgRNA), její sekci působící jako vodítko pro RNA, stejně jako nukleázu proteinu Cas9, která prochází oběma řetězci genomové DNA na uvedeném vodítku RNA.

Ve srovnání s metodou zavedení konstruktu pro náhodné vkládání umožňuje nová metoda vybrat prvky systému CRISPR / Cas9 tak, aby přesně směřovaly vodítka RNA do pravých částí genomu a dosáhli cíleného odstranění nebo vložení požadované DNA sekvence. Chyby jsou také možné v této metodě (průvodce RNA někdy není připojen k regionu, ke kterému je určen), ale pomocí CRISPR / Cas9 je účinnost tvorby transgenu již okolo 80%."Tato metoda má široké vyhlídky, a to nejen pro tvorbu transgenů, ale také v jiných oblastech, zejména v oblasti genové terapie," říká Vadim Zhernovkov. "Technologie je však pouze na začátku a představte si, že v blízké budoucnosti opravit gen kód lidí bude s CRISPR / Cas9 poměrně obtížný. Pokud existuje možnost chyby, existuje nebezpečí, že osoba ztratí nějakou důležitou kódovací část genomu. "

Mléčné léky

Vývoj transgenních technologií umožňuje výrobu živočišných bílkovin požadovaných farmaceutickým průmyslem. Tyto proteiny jsou extrahovány z mléka transgenních koz a krav. Existují také technologie pro získání specifických proteinů z kuřecích vajec.

Ruská společnost Marlene Biotech dokázala vytvořit transgenní myš, ve které byla plně reprodukována mutace vedoucí k Duchennovy myodystrofii a dalším krokem by bylo testování technologií genové terapie. Vytvoření modelů lidských genetických onemocnění založených na laboratorních zvířatech však není jediným možným použitím transgenů. Tak v Rusku a západních laboratořích probíhají práce v oblasti biotechnologie, která umožňuje získat léčivé bílkoviny živočišného původu důležité pro farmaceutický průmysl.Jako producenty mohou být použity krávy nebo kozy, u kterých může být změněno buněčné zařízení pro produkci bílkovin obsažených v mléce. Léčivý protein může být extrahován z mléka, které není získáno chemickými prostředky, ale použitím přirozeného mechanismu, který zvýší účinnost léčiva. V současnosti jsou vyvinuty technologie výroby takových léčivých proteinů, jako je lidský laktoferin, prourokináza, lysozym, atrin, antitrombin a další.


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: